Alessandro d’Este nacque a Ferrara il 5 maggio 1568. Era figlio naturale legittimato di Alfonso II d’Este (a sua volta figlio naturale legittimato del duca Alfonso I), marchese di Montecchio, e di Violante Segni da lui sposata successivamente in seconde nozze. Era fratellastro di Cesare d’Este, futuro duca di Modena e Reggio. Il duca Alfonso II lo tenne presso di sé affidandolo agli insegnamenti di due illustri eruditi del tempo, Antonio Quarenghi e Camillo Coccapani.
Alessandro d’Este era particolarmente portato per le lettere e le lingue straniere. Imparò in facilmente il tedesco, il francese e lo spagnolo, distinguendosi, nel raffinato ambiente della corte ferrarese, per le sue capacità oratorie e per la sua vasta cultura. Il padre con l’intento di avviarlo alla carriera ecclesiastica, lo inviò all’ateneo di Padova, dove Alessandro conseguì brillantemente la laurea nell’una e nell’altra legge.
La gioventù di Alessandro fu caratterizzata costumi assai liberi. Ebbe relazioni sentimentali con Lucrezia Pio di Savoia e con Giulia Constabile, che lo rese padre di una figlia, Giulia Felice, che si farà monaca nel convento di S. Geminiano di Modena.
Solo successivamente egli sviluppò una profonda religiosità e una netta avversione per qualsiasi esteriorità che lo portarono a censurare in specie le sfarzose cerimonie della corte pontificia.
Il 7 aprile 1587, Alessandro, decise di vestire l’abito ecclesiastico per favorire la richiesta della famiglia d’Este che mirava a ottenere dal Papa la sua investitura a cardinale.
Alessandro curò personalmente il trasferimento della capitale a Modena nel delicato momento per gli interessi estensi rappresentato dalla devoluzione di Ferrara dimostrando sempre grande responsabilità e lealtà nei confronti del fratellastro Cesare divenuto il nuovo Duca in successione di Alfonso II. Gli ottimi rapporti con il fratellastro Cesare, portarono Alessandro ad offrire al Duca di Modena un costante sostegno politico-diplomatico. Cesare, da parte sua, ricorse in più di una occasione ai servigi del fratello, come nel dicembre del 1599 quando lo inviò a Sassuolo a incamerare i beni di Marco Pio acerrimo nemico di casa d’Este.
Nonostante diversi tentativi Alessandro ottenne l’investitura cardinalizia solo il 3 marzo del 1599 da Papa Clemente VIII che, probabilmente, intese compensare la casata estense per la perdita di Ferrara.
Poco dopo, il 25 giugno 1599, ottenne anche il titolo di protettore della Corona spagnola. Alessandro forte della sua influenza diplomatica e politica, operò sempre a favore della sua famiglia gestendo moltissimi affari particolari portando costantemente grandi benefici alla casa d’Este. Nel 1608 riuscì a far concludere le nozze del nipote Alfonso (futuro duca di Modena) con Isabella di Savoia, alla quale rimase sempre particolarmente affezionato. In occasione della guerra della Garfagnana tra Modenesi e Lucchesi (1613) diede sfoggio delle sue qualità di mediatore con il governatore di Milano ottenendo di consolidare le vantaggiose posizioni acquistate dall’esercito estense. Tra la fine del 1613 e i primi mesi del 1614 intraprese un viaggio in Spagna alla corte di Filippo III riuscendo a ottenere il riconoscimento dei diritti del duca Cesare sulla Garfagnana e la stabilizzazione della sua area d’influenza sull’Appennino tosco-emiliano. Venne accompagnato da una folta corte di gentiluomini tra i quali spiccavano il marchese Massimiliano Montecuccoli e Giovanbattista Codebò.
Tornato in Italia durante il 1614, si trasferì definitivamente a Roma. Qui egli volle rinnovare i fasti e gli splendori dei suoi illustri parenti. Benché dotato di un esiguo numero di prebende e di benefici ecclesiastici, condusse con sé nella dimora di Montecavallo 400 persone tra servi e familiari mantenendo un tenore di vita che nulla ebbe ad invidiare ai più ricchi principi e cardinali della corte romana.
L’enorme spesa sostenuta dallo stesso duca Cesare per il suo mantenimento suggerì a qualche malevolo cronista del tempo che la sua nomina era stata voluta in realtà dal pontefice per rovinare la casa d’Este.
I rapporti di Alessandro d’Este con la corte pontificia risentirono fortemente della vicenda della devoluzione di Ferrara. Alessandro non nascose mai i suoi intendimenti di recuperare la città al ducato estense dimostrando però sempre un acuto senso della realtà e concentrandosi soprattutto alla definitiva legittimazione del fratello Cesare.
Fu uno dei cardinali protagonisti in ben 4 conclavi riuscendo sempre, grazie alle sue capacità diplomatiche e di valente mediatore, a fare eleggere il proprio candidato di parte filospagnola contro gli antagonisti filofrancesi.
Nominato nel 1605 da Paolo V governatore Tivoli, ebbe lunghe e accanite contese con il cardinale decano T. Galli che pretendeva il possesso della villa in forza una pretestuosa interpretazione del testamento di Ippolito d’Este. Al fine di riportarla per sempre sotto la tutela della sua famiglia, Alessandro d’Este propose al papa Gregorio XV che il suo possesso fosse assegnato in perpetuo ai componenti laici della casata estense. Alla proposta, Gregorio XV rispose positivamente il 10 giugno del 1621 restituendo in perpetuo la villa di Tivoli alla casa d’Este. Alessandro iniziò allora una intensa attività volta a riportare la residenza agli antichi fasti.
Il 16 ottobre 1621, ormai avanti negli anni, venne nominato vescovo di Reggio da Papa Gregorio XV. Nel brevissimo tempo del suo governo donò alla cattedrale una reliquia insigne di un martire tebeo e i corpi dei ss. Aurelio e Aurelia, che furono deposti in un arca marmorea sotto l’altare maggiore.
Il 29 settembre 1623 ricevette anche l’onore di incoronare Papa Matteo Barberini nella solenne cerimonia in S. Giovanni in Laterano.
Morì a Roma il 13 marzo 1624, in seguito ai postumi della malattia (malaria) contratta durante il conclave del 1623.
Dopo le solenni esequie venne sepolto nella cripta della chiesa di S. Maria Maggiore di Tivoli accanto ad altri due cardinali estensi, Ippolito [II] e Luigi.
Fu commemorato anche a Modena, con una funzione religiosa tenuta dall’abate Nicola Baccetti dinanzi all’intera corte estense.